Использование в сыроделии рекомбинантных молокосвертывающих ферментов. Часть 2

Часть 2 Технологические особенности применения рекомбинантных химозинов

ВНИИМС – филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М.Горбатова» РАН, Углич

E-mail: uglich-cheese@mail.ru

УДК 637.3

К настоящему времени на рынке образовался большой ассортимент, представленный ферментными препаратами разного вида. При этом ассортимент ферментных препаратов за последние годы претерпел заметные изменения (см. рис. 1).

Рисунок 1 - изменение рынка МФП в период с 1999 по 2008 годы (по суммарной молокосвертывающей активности), по данным Collin J.-C. [5 - Collin J.-C. Présures et coagulants de substitution: Comment faire le bon choix? 1ère édition //Editions Quae. – 2015. - P. 100].

Как следует из данных, приведенных на рис. 1, доля рекомбинантного химозина (далее – РХ), используемого в производстве возросла почти в 2 раза в период с 1999 по 2008 годы. При этом, в производстве сыров по прежнему продолжается использование натурального СФ, а доля микробных ферментов на рынке только увеличилась. Это выглядит странным, поскольку ранее (на момент начала промышленного выпуска рекомбинантных МФП в 1990-х годах) считалось, что рекомбинантные химозины полностью вытеснят микробные коагулянты, а натуральный СФ будет востребован только в очень малых объемах для производства т.н. «крафтовых» сыров в малых сыроварных. Причина наличия на рынке наряду с рекомбинантными МФП также МФП животного и микробного происхождения связана с наличием у РХ как преимуществ, так и некоторых недостатков в сравнении с МФП животного или микробного происхождения. Среди них главными являются: предубеждения потребителей против РХ, более выраженный вкус сыров изготовленных с МФП животного или микробного происхождения, а также привлекательно-низкая цена микробных МФП.

Однако, РХ имеют множество важных для сыроделов преимуществ, благодаря которым их использование в сыродельной отрасли год от года расширяется. Рассмотрим далее преимущества и недостатки РХ.

Стабильность свертывания молока. Основное преимущество рекомбинантных химозинов – высокая стабильность действия при свертывании молока. Рекомбинантные химозины гарантировано свертывают молоко даже при активной кислотности свежего молока (рН 6,6-6,7), а на продолжительность свертывания мало влияют колебания по содержанию белка и ионов кальция в молоке.

Способность к свертыванию РХ не подкисленного молока весьма важна в виду двух причин:

1. Повышение качества молока, произошедшее к настоящему времени достигнутое за счет повышения гигиены содержания коров, условий дойки и хранения молока, приводит к тому, что на завод поступает молоко с недостаточной кислотностью (на уровне рН 6,6-6,7).
2. Широкое использование в сыроделии бактериальных концентратов и заквасок прямого внесения (DVS – Direct to Vat Starter или DVI – Direct Vat Inoculation). После внесения в сыродельную ванную таких заквасок, происходит процесс активизации, продолжающийся 30-45 мин и не сопровождающийся ростом кислотности молока. Предварительное внесение DVS за 30-45 мин до внесения сычужного фермента в настоящее время признано нежелательным, т.к. это повышает риск поражения культуры бактериофагом и увеличивает продолжительность технологического процесса[Сыр. Научные основы и технологии / П.Л. МакСуини, П.Ф. Фокс, П.Д. Коттер, Д.У. Эверетт (ред.-сост.). – В 2-х т. – Перев. с англ. – СПб.: ИД Профессия, 2019, Т.2 – с. 20-21].

Повышение выхода сыра. При использовании рекомбинантных химозинов достигается более высокий выход сыров, чем при использовании МФП животного или микробного происхождения. Более протеолитически активные, животные и микробные МФП сразу же после внесения в молоко начинают расщепление казеинов с образованием водорастворимых азотистых веществ, которые необратимо переходят в сыворотку на стадии обработки зерна. РХ обладают значительно более низкой протеолитической активностью в отношении казеинов молока. При сравнительных испытаниях рекомбинантных МФП 1-го поколения и натурального сычужного фермента, были получены практически одинаковые показатели по выходу сыров. Лучших результатов по увеличению выхода сыра стало возможным достигнуть после появления рекомбинантных МФП 2-го и 3-го поколения. Сравнительные данные по выходу сыров, произведенными с рекомбинантными химозинами приведены в таблице.

Таблица – Выход сыров произведенных с использованием рекомбинантных химозинов разного поколения в сравнении с натуральным сычужным ферментом

Увеличение срока хранения сыра. Низкая степень неспецифического протеолиза рекомбинантных химозинов позволяет достигнуть увеличения срока хранения сыров выработанных с такими МФП. Известно, что плотность консистенции сыра зависит от степени протеолиза белков сырной массы. Чем медленнее процесс протеолиза, тем медленнее идет разрушение белковой матрицы сыра, тем медленнее размягчается сырная масса, тем дольше срок хранения сыра. К примеру, плотная консистенция обязательна для некоторых видов сыров, например – для сыра Чеддер. Долгое время проблемой было сохранение плотной консистенции сыров в течение длительного срока хранения. В отличие от сыров с высокой температурой второго нагревания, в которых МФП инактивируется под действием температуры 2-го нагревания и не оказывает расщепляющего действия на белковый каркас сыра, в технологии сыра Чеддер используется низкая температура 2-го нагревания не позволяющая инактивировать фермент. В результате МФП сохраняет активность, переходит в состав сыра Чеддер и, далее, в результате протеолитического действия приводит к нежелательному размягчению консистенции. Существовавшая проблема размягчения консистенции сыра Чеддер (и других сыров с низкой температурой второго нагревания) может быть успешно решена за счет использования в производстве сыров РХ. Использование для производства сыра Чеддер рекомбинантных МФП с низкой протеолитической активностью позволяет обеспечить сохранность консистенции сыра Чеддер на протяжении длительного срока хранения.

В сырах с высоким содержанием влаги, протеолиз протекает с повышенной скоростью. В т.ч. это касается и сыров с чеддеризацией и плавлением сырной массы (Паста Филата, Моцарелла, Сулугуни). Типичная тянущаяся при нагревании текстура этих сыров утрачивается в результате протеолиза белков сырной массы. Использование при производстве сыра Моцарелла МФП с высоким соотношение C/P позволит обеспечить сыру длительное сохранение желательной консистенции и увеличить срок хранения до 12 недель (2,5-3 месяца) [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – URL: https://mejeritekniskselskab.dk/sites/default/files/dms/Seminarprogrammer/ulf_mortensen_new_syrning_og_koagulering_i_mozzarella_apr2018_final_version.pdf (дата обращения 11.07.2019 г.)].

На рис. 2 приведена динамика протеолиза в сырах с чеддеризацией и плавлением сырной массы, произведенных с использованием МФП разного вида.

Рисунок 2 – динамика протеолиза в сырах с чеддеризацией и плавлением сырной массы типа «Паста Филата» (Моцарелла, Сулугуни, Качкавалло), произведенных с МФП разного вида (по данным [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – URL: https://mejeritekniskselskab.dk/sites/default/files/dms/Seminarprogrammer/ulf_mortensen_new_syrning_og_koagulering_i_mozzarella_apr2018_final_version.pdf (дата обращения 11.07.2019 г.)])

Применение МФП с низким уровнем неспецифического протеолиза позволяет достигнуть длительного сохранения консистенции сыров типа Паста Филата.

Рисунок – влияние типа используемого МФП на степень протеолиза и продолжительность хранения сыров типа «Паста Филата» [Syrning og koagulering I mozzarella produktion – URL: https://mejeritekniskselskab.dk/sites/default/files/dms/Seminarprogrammer/ulf_mortensen_new_syrning_og_koagulering_i_mozzarella_apr2018_final_version.pdf (дата обращения 11.07.2019 г.)].

Аналогично, в целях повышения срока хранения, МФП с высоким соотношением C/P целесообразно применять и для других разновидностей сыров.

Согласно рекомендациям зарубежных исследователей, рекомбинантные химозины целесообразно применять:

• в целях повышения выхода сыра
• для увеличения сроков хранения сыров
• при производстве сыров с чеддеризацией и плавлением сырной массы для получения тянущейся структуры сохраняющейся на протяжении длительного срока хранения [The Search For Long-Lasting Texture: Overcoming Challenges Making Mozzarella – URL: https://npaper-wehaa.com/cheese-reporter/2014/07/s1/#?article=2279802 (дата обращения 10.07.2019 г.)]
• при производстве сыров, созревающих с участием микрофлоры поверхностной слизи (для замедления размягчения консистенции и удлинения сроков хранения)
• получения плотной консистенции сыра, облегчающей нарезание и натирание сыра для порционной упаковки.

Наибольшее применение рекомбинантный химозин находит в сыродельной промышленности США и стран Британского содружества (Великобритания, Ирландия, Канада, Австралия и Новая Зеландия). Там доля рекомбинантного химозина, среди используемых МФП, составляла 80-90 % [Jaros D., Rohm H. In Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology (ed. McSweeney P.L.H., Fox P.F., Cotter P.D., Everett D.W.), 4th edition, Chapter 3 – Rennets: Applied Aspects, 2017,  Academic Press – P. 53-57]. Это связано с тем, что преобладающими разновидностями сыров выпускаемых в США и Великобритании является Чеддер и Моцарелла, для производства которых, как сказано выше, рекомбинантный химозин является наилучшим видом фермента.

В 2010 году, производство сыров в странах Британского содружества (Великобритания, Ирландия, Новая Зеландия, Австралия, Канада) и США составило:

• Чеддер – 2 230 тыс. тонн;
• Моцарелла – 2 040 тыс. тонн;
• Гауда – 1 650 тыс. тонн.

Значительный уровень производства сыра Чеддер в указанных странах в значительной мере связан с ориентацией на экспорт сыров. При экспортных поставках необходимо обеспечить сохранность качества сыра, в т.ч. при хранении в условиях неконтролируемых температур, обеспечить длительный срок годности сыра. Этому способствует как химический состав сыра Чеддер (низкое содержание влаги, низкий уровень рН, сравнительно высокое содержание соли), так и использование рекомбинантных химозинов, обеспечивающих ограниченный протеолиз, что дает длительное сохранение плотной консистенции и умеренно-выраженного вкуса сыра.

Моцарелла является наиболее популярным сыром в США, потребление которого составляет третью часть от всего потребления сыров в США. Главной причиной этого является широкое использование Моцареллы в индустрии быстрого питания, в т.ч. в качестве компонента пиццы [WORLD CHEESE MARKET 2000-2020 – URL: www.pmfood.dk/upl/9735/WCMINFORMATION.pdf (дата обращения 10.07.2019 г.)].

Вместе с тем, рекомбинантные химозины имеют и ряд недостатков, которые являются прямым следствием их достоинств. Как сказано выше, вследствие наличия низкой протеолитической активности у рекомбинантных химозинов, использование их при производстве сыров позволяет обеспечить высокий выход и длительный срок хранения сыра. Но низкая степень протеолиза желательная в определенных случаях и для отдельных видов сыров, не желательна для других видов сыров. К примеру, для сыров Голландского типа (Эдам, Гауда, Маасдам) недостаточная степень протеолиза ведет к получению излишне плотной, резинистой консистенции и не выраженного вкуса сыра. Об отрицательном влиянии на вкусовые показатели сыров типа Голландского МФП с низкой протеолитической активностью было известно еще до внедрения в практику сыроделия рекомбинантных химозинов. По данным исследований, проведенных еще в середине 20 века, было установлено, что сыры, изготовленные с химически чистым телячьим химозином, имели недостаточную степень зрелости (невыраженный вкус и излишне плотную консистенцию), в сравнении с сырами, выработанным с препаратами телячьего химозина стандартной очистки [Климовский И.И. Биохимические и микробиологические основы производства сыра. М.: Пищевая промышленность, 1966, с. 8-11].

Невыраженный или нетипичный вкус сыра отталкивает покупателей. В частности, во Франции, которая является страной развитого сыроделия, со сложившимися за столетиями традициями производства и потребления сыра, с учетом интересов потребителей, продолжают делать сыры с использованием традиционного СФ или микробных коагулянтов, обеспечивающих быстрое созревание и насыщенный вкус сыров. По состоянию на 2012 год, во Франции, доля рекомбинантного химозина, среди коагулянтов используемых в сыроделии составляла всего 14 % [6 - Rolet-Repecaud, O. Characterization of the non-coagulating enzyme fraction of different milk clotting preparations / O. Rolet-Repecaud, F. Berthier, E. Beuvier, S. Gavoye, E. Notz, S. Roustel, V. Gagnaire, C. Achilleos // LWT Food Sci. Technol. – 2013. – Vol. 50, P. 459–468]. Рекомбинантный химозин не востребован также в сыродельной промышленности Голландии и Германии, выпускающих в основном т.н. "континентальные" сорта сыров (Эдам, Гауда, Маасдам), характеризуемые пластичной консистенцией и выраженным сырным вкусом, чего нельзя в полной мере достигнуть при использовании для их производства рекомбинантных химозинов.

При использовании рекомбинантного химозина, для получения сыра с выраженным вкусом рекомендуется использовать специальные заквасочные культуры для ускорения созревания, например DVS® CR Full Flavor (Chr Hansen A/S) или Delvo®Cheese CT-Taste (DSM Food Specialties). Но такой подход ведет к дополнительным расходам.

Признавая полное отсутствие всякого протеолиза за недостаток рекомбинантных МФП, производители начали выпуск МФП на основе рекомбинантных химозинов, обладающих «контролируемым» протеолизом. Для усиления недостаточной протеолитической активности или изменения ее специфичности, препараты рекомбинантного химозина модифицировали, путем введения в их состав дополнительных протеолитических ферментов. Примерами таких МФП могут быть:

• препарат CHY-MAX® Special (Chr Hansen A/S), который содержит в своем составе 80 % рекомбинантного химозина верблюда и до 20 % бычьего пепсина [Молокосвертывающий фермент жидкий CHY-MAX Liquid, Special – URL: http://www.uraling.ru/xcat/89];
• препарат Maxiren® Premium P/PC (DSM Food Specialties), жидкий препарат рекомбинантного химозина теленка, смешанный с карбоксипептидазой, полученной из отобранного штамма Aspergillus niger [Maxiren® Premium P / PC, Enzymes. Product description. https://www.ingredientsnetwork.com/maxiren-premium-p-pc-enzymes-prod114181.html https://www.vrg.org/blog/2012/08/21/microbial-rennets-and-fermentation-produced-chymosin-fpc-how-vegetarian-are-they/].

Фирма Chr Hansen рекомендует использовать препарат Chy-max® Special для производства мягких сыров созревающих с участием поверхностной микрофлоры. Использование Chy-max® Special при производстве сыра Камамбер дает две выгоды:

1. Быстрое накопление достаточного количества растворимого азота для требуемого размягчения консистенции и формирования вкуса сыра (счет повышенной активности пепсина в условиях низкого уровня рН сыра на начальной стадии созревания)
2. Длительное сохранение плотной консистенции сыра в хранении (за счет ослабления протеолитической активности пепсина в следствие повышения рН сыра на поздних стадиях созревания).

Динамика протеолитических процессов в вариантах сыра Камамбер, произведенных с применением препарата Chy-max® Special и традиционно используемых коагулянтов, приведена на рис. 3. 

Рисунок 3 – изменение соотношения растворимого к общему азоту при созревании образцов сыра Камамбер, произведенны с разными коагулянтами (по данным [10]).

На рис. 3, темным прямоугольником на графике выделена область, соответствующая уровню протеолиза в зрелом сыре. Сыр Камамбер, изготовленный с препаратом Chy-max® Special достигает кондиционной зрелости в тот же срок, что и сыр, изготовленный с натуральным сычужным ферментом, но имеет при этом более долгий срок хранения.

Препараты рекомбинантного химозина с «дополненной» протеолитической активностью появились сравнительно недавно и пока не оценены сыроделами. По собственным данным авторов статьи, препарат Maxiren Premium P поставляется в Россию в очень малых объемах (641 л препарата за 2017 год), а препарат Chy-Max® Special в Россию не поставляется.

Результаты использования рекомбинантных химозинов при производстве сыров широко описаны в литературе. Рекомбинантные химозины вырабатываемые E. coli, Aspergillus niger и Kluyveromyces lactis, были исследованы при производстве множества различных видов сыров (мягкие сыры, сыры с низкой и высокой температурой второго нагревания, рассольные сыры, сыры с чеддеризацией и плавлением сырной массы, сыры созревающие с участием плесени, сыры созревающие с участием поверхностной микрофлоры). Во всех случаях, исследователями не было обнаружено существенных различий по выходу сыра, по скорости созревания и по вкусовым показателям между сырами изготовленными с применением рекомбинантных химозинов 1-го поколения и между сырами, произведенными с натуральным телячьим сычужным ферментом [Jacob M. Recent advances in milk clotting enzymes / M. Jacob, D. Jaros, H. Rohm // International Journal of Dairy Technology. –2011. – Vol. 64(1). – P. 14–33].

При сравнении препарата рекомбинантного химозина теленка и микробных коагулянтов при производстве сыра Моцарелла, было обнаружено, что рекомбинантный химозин 1-го поколения дает меньший уровень протеолиза в сравнении с микробными коагулянтами, что позволяет увеличить срок хранения сыра с рекомбинантным химозином [Sheehan J.J. Effect of coagulant type and storage temperature on the functionality of reduced-fat Mozzarella cheese / J.J. Sheehan, K. O’Sullivan, T.P. Guinee // Lait – 2004. – Vol. 84(6). – P. 551–566].

В следствие меньшей протеолитической активности рекомбинантного химозина верблюда (РХ 2-го поколения), сыры производимые с его использованием имеют более плотную консистенцию и менее выраженный вкус, чем сыры производимые с сычужным ферментом или микробными коагулянтами.

При производстве низкожирного сыра Чеддер использование рекомбинантного химозина верблюда привело к получению излишне плотной консистенции, что было связано с более плотной структурой белковой матрицы сыра из-за слабого протеолиза, проявляемого препаратом химозина верблюда [Soodam K. Effect of rennet on the composition, proteolysis and microstructure of reduced-fat Cheddar cheese during ripening / K. Soodam, L. Ong, I.B. Powell, S.E. Kentish, S.L. Gras // Dairy Sci. & Technol. –2015. – Vol. 95. – P. 665–686].

Сравнительное испытание препаратов рекомбинантного химозина теленка и верблюда при производстве полножирного сыра Чеддер показало, что после 150 сут созревания, что сыры выработанные с химозином верблюда обладали более плотной консистенции и менее выраженным вкусом. Сыры, произведенные с рекомбинантным химозином теленка получили более высокую оценку за более пластичную консистенцию и выраженный вкус. Вместе с тем, была отмечена существенно меньшая выраженность горького вкуса в сыра, произведенных с химозином верблюда [Bansal N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal, M.A. Drake, P. Piraino, M.L. Broe, M. Harboe, P.F. Fox, P.L.H. McSweeney // International Dairy Journal – 2009. – Vol. 19(9). – P. 510–517].

В качестве примера, в табл. 1 приведен современный ассортимент МФП на основе рекомбинантных химозинов, и рекомендации по их применению.

Таблица 1 – Современный ассортимент коагулянтов разного типа

Целесообразность специализированного использования МФП разного вида, для производства разных видов сыров, подтверждают испытания проведенные во ВНИИМС. В ходе испытаний были изучены технологические свойства сычужного фермента и рекомбинантных химозинов теленка и верблюжонка (молокосвертывающая и общая протеолитическая активность), а также свойства сыров, произведенных с этими ферментами. Выбранные для исследования ферментные препараты были испытаны при выработках сыра Голландский. Сыры вырабатывали согласно Сборнику типовых технологических инструкций по производству полутвердых сыров [ТИ ГОСТ 32260-2013 Сборник технологических инструкций по производству полутвердых сыров, разработанный ВНИИ маслоделия и сыроделия, утвержденный директором ФГБНУ ВНИИМС 19.05.2015 г.]. Дозу внесения молокосвертывающего фермента определяли сычужной пробой с применением кружки ВНИИМС. 

Созревание сыров проводили при следующих режимах: 14 сут при температуре (10-12) °С и 30 сут при температуре (12-14) °С. После завершения созревания, хранение зрелого сыра осуществлялось при температуре (2-4) °С.

Накопление водорастворимых продуктов протеолиза в сырах с препаратами натурального и рекомбинантного телячьего химозина идет практически на одинаковом уровне. В сырах, произведенных с препаратом рекомбинантного химозина верблюда темпы накопления водорастворимого азота заметно ниже, чем в сырах с препаратами химозина теленка. Различия в течении протеолитических процессов при созревании и хранении сыров с разными видами химозинов, сказались на их органолептических показателях. Сыры выработанные с натуральным сычужным ферментом в конце срока созревания приобретают эластичную консистенцию, которая немного размягчается в процессе хранения. Сыры с рекомбинантны химозином теленка в конце срока созревания имеют немного более плотную консистенцию, которая также немного размягчается за срок хранения. Консистенция сыров произведенных с рекомбинантным химозином верблюда более плотная, чем у сыров, с химозином теленка (как с натуральным, так и с рекомбинантным), как по завершении срока созревания, так и через 3 месяца хранения. В сырах, произведенныхс рекомбинантными химозинами, чаще отмечается самокольные трещины. Т.о. меньший уровень протеолиза в сырах с рекомбинантными химозина сопутствует более плотной консистенции и менее выраженному вкусу таких сыров.

Выводы:

На основании данных, полученных как при изучении иностранного опыта, так и в результате собственных исследований по вопросам применения рекомбинантных химозинов в сыроделии, можно сделать следующие выводы:

• рекомбинантный химозин является специализированным технологическим средством, которое надо использовать для специальных целей
• вкус сыров получаемых с использованием рекобминантного химозина – более бедный в сравнении со вкусом сыров с натуральным телячьим сычужным ферментом, а консистенция более плотная, вызывающая склонность к появлению самокольных трещин в сыре,
• рекомбинантный химозин верблюда больше подходит для сыров с плотной консистенцией (н-р, сыр Чеддер) и для которых необходимо обеспечить длительную сохранность консистенции (н-р, сыр Моцарелла), но не подходят для традиционных в России видов сыров с низкой температурой второго нагревания (н-р, сыр Голландский) из-за получения излишне плотной консистенции и бедного вкуса;
• можно рекомендовать использовать рекомбинантные химозины в производстве сыров с низкой температурой второго нагревания для увеличения срока их хранения с рядом оговорок: такие сыры должны быть упакованы в пленку ранней стадии созревания для недопущения усушки сырной массы, способствующей появлению самокольных трещин.

Неоспоримым преимуществом рекомбинантного химозина является гарантированное стабильно высокое качество производимых с ним сыров и возможность промышленного выпуска рекомбинантного химозина в любых необходимых объемах. Исходя из текущих тенденций на рынке МФП, следует ожидать дальнейшего усовершенствования свойств МФП и разделения их по направления использования, например, создание МФП для сыров с ускоренным сроком созревания, для сыров с длительным сроком хранения и для сыров разных видов с разной спецификой созревания.

Источник: ПРОДУКТ.BY