Маститы. Разработка Межгосударственного стандарта на методы определения соматических клеток

Во всем мире, в том числе и в нашей стране, проблема маститов стоит на одном из первых мест, определяющих безопасность и санитарно-гигиенические показатели молока.

Г.М. Свириденко ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии, г. Углич

Содержание соматических клеток – важнейший косвенный показатель здоровья вымени, так как при воспалительном процессе резко увеличивается в молоке количество клеток крови, в частности лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, которые могут поглощать клетки патогенных микроорганизмов – возбудителей мастита и в молочной железе играют защитную функцию.

Кроме клеток крови, к соматическим клеткам относятся любые клетки организма, кроме половых. Клетки вымени (эпителиальные клетки) попадают в молоко естественным путем из молоковыводящих каналов в ходе старения и обновления эпителия и являются постоянной составной частью молока. В молоке здоровой коровы они составляют 60-70 % от общего количества соматических клеток и не влияют на качество и безопасность. Нормальное фоновое содержание соматических клеток в молоке колеблется в зависимости от возраста, периода лактации, породы и индивидуальных особенностей животного от 100 до 500 тыс. соматических клеток в 1 см³. Наличие в молоке из отдельной доли вымени менее 500 тыс/см3 соматических клеток при отсутствии патогенных бактерий свидетельствует о нормальной секреции, при наличии патогенов – о скрытой инфекции вымени. В международной практике установлена верхняя граница допустимого содержания соматических клеток в молоке из одной четверти вымени 5•10⁵клеток. Для сборного молока границу устанавливают обычно ниже – 3•105-5•105 клеток в 1 см³.

В соответствии с Техническим регламентом на молоко и молочную продукцию (№ 88-ФЗ, № 163-ФЗ) содержание соматических клеток в молоке высшего сорта не должно превышать 4•105 клеток в 1 см³, а для молока первого и второго сорта – 1•106 клеток в 1 см³. По данному показателю сыропригодным может быть только молоко высшего сорта. В проекте технического регламента Таможенного союза допустимая норма содержания в молоке сыром соматических клеток – 7,5•105 в 1 см³, при этом для молока сырого, предназначенного для производства детского питания, сыров и стерилизованного молока – не более 5•105 клеток в 1 см³.

С повышением содержания соматических клеток возрастает частота обнаружения в молоке и молочных продуктах патогенных бактерий – возбудителей мастита, в том числе стафилококков и стрептококков. Особенно важное значение этот факт имеет для Российского сыра, способ формования которого создает условия для развития аэробных микроорганизмов, в том числе стафилококков. Содержание в молоке соматических клеток более 3•105 в 1 см³ задерживает размножение заквасочных микроорганизмов. Таким образом, можно считать, что содержание соматических клеток является важнейшим комплексным показателем сыропригодности молока.

Очень важно, что содержание соматических клеток можно легко и быстро определить в молоке. Существует несколько способов диагностики субклинических маститов. Для выявления в заготовляемом сырье примеси анормального молока, используются прямые и косвенные методы, основанные на определении количества соматических клеток.

Всероссийским научно-исследователь-ским институтом сертификации на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта сделан ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)», который идентичен международному стандарту ИСО 13366-1:2008 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)» [ISO 13366-1:2008 «Milk – Enumeration of somatic cells – Part 1: Microscopic method (Reference method)»]. Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.

Анализ результатов, полученных при определении соматических клеток в молоке данным методом в условиях отдела микробиологии ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии, а также в рамках совместных международных исследований коровьего молока в 2005 г. при участии восемнадцати лабораторий из тринадцати стран, свидетельствует о том, что данный метод может быть реализован только в условиях специализированных лабораторий. Подтверждением вышесказанного служат результаты анализа 8 проб молока в 18 лабораториях. Данные испытаний показывают, что из 144 проб (8 проб в 18 лабораториях) пригодными для статистического анализа были признаны только 95, а 49 участников были исключены по причине резко отклоняющихся результатов.

Есть негативные примеры использования данного метода в молочной промышленности, в частности на предприятиях Украины, пытающихся полностью гармонизироваться с международными стандартами и проверяющих правильность работы вискозиметров, сравнивая их результаты с вышеописанным методом микроскопического подсчета соматических клеток. Использование настоящего стандарта сопряжено с применением опасных материалов, требует специального оснащения приборами и оборудованием. На пользователя настоящего стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до его использования на практике.

Подготовка и профессиональное мастерство микробиолога являются основными решающими факторами успешного использования метода. Для обеспечения надлежащего уровня подсчета необходимы как теоретические знания, так и большие практические навыки.

К косвенным методам определения количества соматических клеток в молоке относятся методы их выявления при взаимодействии с определенными реагентами. В настоящее время определение количества соматических клеток в молоке регламентируется ГОСТ Р 54077-2010 «Молоко. Методы определения количества соматических клеток по изменению вязкости» и проводится с использованием диагностических препаратов типа «Мастоприм» визуальным способом и с применением вискозиметра. Стандарт разработан ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии.

Метод основан на воздействии сульфанола – поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата Мастоприм, на клеточную оболочку соматических клеток, что приводит к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция), что фиксируется визуально или вискозиметром. Для анализа используется вискозиметр капиллярного типа, откалиброванный производителем прибора на определение количества соматических клеток в сыром молоке.

Существует метод контроля соматических клеток в молоке сыром, основанный на принципе флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval. В настоящее время данный метод не включен ни в один национальный или международный стандарт, поэтому, на основании законодательства РФ, может использоваться только для проведения внутрипроизводственного контроля, а результаты анализов не могут быть использованы в случае арбитражных споров.

Однако данный метод широко используется молочными хозяйствами как в странах Европы, так и Таможенного союза. В отделе микробиологии ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии в рамках темы «Создать систему контроля молока-сырья и разработать исходные требования к молоку-сырью для сыроделия», выполняемой в соответствии с Программой фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ Российской академии сельскохозяйственных наук в период с 2006 по 2010 гг., накоплен значительный экспериментальный материал, позволивший после статистического анализа результатов определения соматических клеток в молоке сыром разными методами, дать предложение о включении метода флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DeLaval DCC в программу международной стандартизации.

Сущность метода заключается в том, что цитоплазматическая мембрана соматических клеток разрушается под действием лизогенного буфера, после чего ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя, в качестве которого используется пропидий йодид (Propidium Iodide – PI). Пропидий йодид связывается с двухспиральной ДНК соматических клеток, и образуется флуоресцентное вещество, поглощающее зеленый свет и излучающее красный, идентифицирующее клетки. Таким образом, система дает изображение клеток, а встроенный в анализатор компьютер с помощью программного обеспечения подсчитывает количество белых точек, что соответствует количеству соматических клеток.

В отделе микробиологии ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии было проведено сравнительное исследование четырех образцов сырого молока на количество соматических клеток, определяемых при помощи прямого метода микроскопирования и косвенных методов: по изменению вязкости на вискозиметре Соматос-МИНИ и флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval. Для оценки воспроизводимости результатов каждое определение количества соматических клеток выполнено в двух повторностях. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Приведенные результаты показывают, что при очень низком уровне содержания в молоке соматических клеток в данной серии опытов наименьшие результаты получены с использованием счетчика соматических клеток, однако разброс данных укладывается в допустимую ошибку повторяемости 12 %. С увеличением в пробах количества соматических клеток, результаты измерений, получаемые различными методами, сближаются. При содержании в молоке соматических клеток порядка 106/см³, метод прямого микроскопирования дает более высокие результаты, чем косвенные методы контроля. Таблица 1 Сравнительные испытания прямого и косвенных методов контроля количества соматических клеток в молоке